Pesquisadores holandeses combinam CRISPR e bioluminescência em um teste experimental paradoenças infecciosas

Uma proteína noturna recentemente desenvolvida poderia acelerar e simplificar o diagnóstico de doenças virais, segundo investigadores nos Países Baixos.
Seu estudo, publicado quarta-feira na ACS Publications, descreve um método sensível e de uma etapa para analisar rapidamente os ácidos nucléicos virais e sua aparência usando proteínas azuis ou verdes brilhantes.
A identificação de agentes patogénicos através da detecção das suas impressões digitais de ácidos nucleicos é uma estratégia fundamental no diagnóstico clínico, na investigação biomédica e na monitorização da segurança alimentar e ambiental.Os testes quantitativos de reação em cadeia da polimerase (PCR) amplamente utilizados são altamente sensíveis, mas exigem preparação sofisticada de amostras ou interpretação de resultados, tornando-os impraticáveis ​​para alguns ambientes de saúde ou com recursos limitados.
Este grupo da Holanda é o resultado de uma colaboração entre cientistas de universidades e hospitais para desenvolver um método de diagnóstico de ácido nucleico rápido, portátil e fácil de usar, que pode ser aplicado em diversos ambientes.
Eles foram inspirados em flashes de vaga-lumes, brilhos de vaga-lumes e pequenas estrelas de fitoplâncton aquático, todos alimentados por um fenômeno chamado bioluminescência.Este efeito que brilha no escuro é causado por uma reação química envolvendo a proteína luciferase.Os cientistas incorporaram proteínas luciferase em sensores que emitem luz para facilitar a observação quando encontram um alvo.Embora isso torne esses sensores ideais para detecção no local de atendimento, atualmente eles não possuem a alta sensibilidade necessária para testes de diagnóstico clínico.Embora o método de edição genética CRISPR possa fornecer essa capacidade, ele requer muitas etapas e equipamento especializado adicional para detectar o sinal fraco que pode estar presente em amostras complexas e ruidosas.
Os pesquisadores descobriram uma maneira de combinar uma proteína relacionada ao CRISPR com um sinal bioluminescente que pode ser detectado com uma simples câmera digital.Para garantir que havia amostra suficiente de RNA ou DNA para análise, os pesquisadores realizaram a amplificação da recombinase polimerase (RPA), uma técnica simples que opera a uma temperatura constante de cerca de 100°F.Eles desenvolveram uma nova plataforma chamada Sensor Luminescente de Ácido Nucleico (LUNAS), na qual as duas proteínas CRISPR/Cas9 são específicas para diferentes porções contíguas do genoma viral, cada uma com um fragmento único de luciferase anexado a elas acima.
Quando o genoma viral específico que os investigadores estão examinando está presente, duas proteínas CRISPR/Cas9 se ligam à sequência de ácido nucleico alvo;eles ficam próximos, permitindo a formação da proteína luciferase intacta e a emissão de luz azul na presença de um substrato químico..Para contabilizar o substrato consumido nesse processo, os pesquisadores utilizaram uma reação de controle que emitia luz verde.Um tubo que muda de cor de verde para azul indica um resultado positivo.
Os pesquisadores testaram sua plataforma desenvolvendo o ensaio RPA-LUNAS, que detectaARN SARS-CoV-2sem o tedioso isolamento de RNA e demonstrou seu desempenho diagnóstico em amostras de esfregaço nasofaríngeo deCOVID 19pacientes.O RPA-LUNAS detectou com sucesso o SARS-CoV-2 em 20 minutos em amostras com carga viral de RNA tão baixa quanto 200 cópias/μL.
Os pesquisadores acreditam que seu ensaio pode detectar muitos outros vírus de maneira fácil e eficaz.“RPA-LUNAS é atraente para testes de doenças infecciosas no local de atendimento”, escreveram eles.